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摘要 衛(wèi)福部食藥署公告之食品微生物單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)檢驗的方法中，建議 先將檢體增菌後，再接種於選擇性培養(yǎng)基（如MOX或PALCAM agar），然後將生長的疑似菌落移種至血 平板(blood agar plate, BAP)上進行 -溶血試驗；而於臨床檢驗中，則直接將檢體接種至血平板上。兩種檢 驗專業(yè)均以生長菌之溶血現(xiàn)象做為初步鑑別的依據(jù)，然而，李斯特菌在BAP培養(yǎng)後之第一天的生長菌落甚 小，且溶血現(xiàn)象通常微弱而不明顯，操作者不易觀察，而易導(dǎo)致漏檢。有鑑於此，為了提升李斯特菌生長 菌落的溶血效果，本研究以李斯特菌標(biāo)準菌株(ATCC 19111)接種至添加溶血加強劑（啟新公司提供）之各 種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的血平板上，基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分分別為Trypticase soy agar（胰化酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基，TSAII）、Columbia agar（哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基)、Brucella agar（布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基）與Brain heart infusion agar（腦心浸出物瓊脂培養(yǎng)基，BHIA）。接種後的各種血平板於35±1℃培養(yǎng)，分別於24及 48小時觀察菌 落特徵，以探討溶血加強劑對其生長促進效能以及對菌落溶血圈直徑大小的影響，結(jié)果指出，含有溶血加 強劑之各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基配製成的血平板上，李斯特菌生長能力正常，所有菌落的溶血圈環(huán)比未添加之對照 組皆有增大情形，而顯現(xiàn)更易觀察，並可縮短的判讀時間 (24 h)，在食品或臨床檢驗上，添加溶血加強劑 之血平板可降低李斯特菌之漏檢或判讀錯誤的情況發(fā)生，值得檢驗人員善加利用。
關(guān)鍵字：單核球增多性李斯特菌、溶血加強劑、 -溶血、血平板培養(yǎng)基
前言
單核球增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下簡稱李斯特菌），此菌於 3-45℃溫度範(fàn)圍內(nèi)可增菌[1]，而最適生長溫 度為30-37℃，且可於血平板培養(yǎng)基上呈現(xiàn) -溶血(beta-hemolysis，菌落周圍呈完全溶血) 之生化特性[2]。普遍存於水、泥土等周遭環(huán) 境，亦存在於加熱未完全或受污染之蔬菜、肉品及乳制品，其引起的感染癥為李斯特菌 癥(Listeriosis)，主要以食品作為傳染途徑之 媒介，患者通常會發(fā)生發(fā)燒、頭痛或腸胃不 適等癥狀，如噁心、嘔吐及腹瀉等現(xiàn)象，也 可能引發(fā)嚴重併發(fā)癥，例如：腦膜炎或敗血 癥，孕婦、嬰兒、年長者、或免疫力較弱的 人受感染的風(fēng)險較高[3]。且李斯特菌癥已於 2018年 1 月 1 日被衛(wèi)生福利部疾病管制署列 為「傳染病防治法」規(guī)定之第四類傳染病[4]。 根據(jù)吾等統(tǒng)計2018年 1-8月引發(fā)全球主要食 安事件的病原菌，依食安事件數(shù)的比例顯示 李斯特菌僅略少於沙門氏菌，位居第二（表 1）[5-6]，由此可見其對於食品安全之重要性
由於李斯特菌在平板上生長之菌落直徑 較小、溶血圈較不明顯而不易觀察。根據(jù)衛(wèi) 生福利部食品藥物管理署公告之檢驗方法， 李斯特菌初步鑑定之 -溶血試驗 ( -hemolysis test) 為將食品檢體先接種至選擇性培養(yǎng)基 如：MOX（改良式牛津培養(yǎng)基，Modified Oxford medium）、PALCAM（帕爾康李斯 特菌選擇性培養(yǎng)基，PALCAM Listeria Selective agar）或顯色性培養(yǎng)基 (CHROMagar) 後， 再將懷疑為李斯特菌之菌落移種至含綿羊血 之血平板並培養(yǎng)48小時，然而，一般李斯特 菌菌落將呈微弱溶血現(xiàn)象[7]，而降低其判讀 結(jié)果的準確性，將影響李斯特菌從食品中分 離的陽性率[8]；另外，於臨床檢體的李斯特 氏菌檢驗中，將檢體（如腦脊髓液、產(chǎn)道分 泌物等）直接接種至血平板上，根據(jù)菌落的 溶血現(xiàn)象，再進一步純化及鑑定，若溶血現(xiàn) 象不明顯，將使操作者觀察困難，而導(dǎo)致漏 檢。 衛(wèi)福部公告之食品微生物檢驗方法[7]與 中華人民共和國國家標(biāo)準[9]，對於李斯特菌 的溶血試驗皆建議接種懷疑菌落至以TSA-II （胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基，Trypticase soy agar-II）配製含5% 綿羊血的血平板，培養(yǎng) 48小時，再以判讀溶血情形；而臨床李斯特 菌檢驗中，多使用以含 TSA-II 或 Columbia agar（哥倫比亞瓊脂）基礎(chǔ)培養(yǎng)基所配製的 血平板。 為了促進李斯特菌之 -溶血情形於血液 平板上更加明顯，本研究以TSA-II、Columbia agar、Brucella agar（布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基） 及 BHIA（腦心浸出物瓊脂培養(yǎng)基，Brain heart infusion agar）作為不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基之 血平板並添加溶血加強劑（Hemolysis enhancer，啟新生技公司研發(fā)與提供），接種測 試的李斯特菌於上述幾種血平板中，培養(yǎng)後 進行李斯特菌之溶血環(huán)大小及判讀清晰度比 較。研究中所使用之溶血加強劑曾應(yīng)用於CMPTM / GBS detection agar（啟新生物科 技有限公司，臺灣）中，可誘導(dǎo)B 群鏈球菌 （GBS，乙型鏈球菌，Streptococcusagalatiae） 的 -溶血型變成為 -溶血型，而不影響其他 測試菌的溶血型式及菌落之外觀，該研究同 時指出溶血加強劑並不會改變李斯特菌之溶 血形態(tài)，使其仍維持 -溶血型[10]。有鑒於此， 本研究結(jié)果將觀察含溶血加強劑的血平板對 李斯特菌菌落之 -溶血環(huán)大小的影響。
表 1. 2018年 1-8月引發(fā)全球主要食安事件 的病原菌統(tǒng)計
污染菌名稱 食安事件數(shù) 比例 沙門氏菌 48 37.5% 李斯特菌 39 30.5% 產(chǎn)毒性大腸桿菌 24 18.8% 肉毒桿菌 7 5.5% 阪崎腸桿菌 1 0.8% 仙人掌桿菌 1 0.8% A 型肝炎 3 2.3% 諾羅病毒 2 1.6% 未指出菌名 3 2.3% 總數(shù) 128 100%
材料方法
菌株製備 本研究使用Listeria monocytogenes ATCC 19111 作為培養(yǎng)基效能評估的菌株，此菌保 存於-70℃冷凍庫，測試前移種至 BAP （血 平板，blood agar plate，啟新生物科技有限 公司，新北市），培養(yǎng)於35±1℃ CO2培養(yǎng)箱 中 22~24小時後，再接種至另一BAP進行第 二次活化。
菌液之製備 欲取得適當(dāng)菌量之李斯特菌菌液以塗抹 於培養(yǎng)基上，故先以接種環(huán)鈎取BAP上已活 化之李斯特菌菌落至5 mL TSBYE（胰化酪
蛋白大豆酵母抽出物培養(yǎng)液，Trypticase soy broth with 0.6% yeast extract）中，調(diào)菌液 至相當(dāng)於McFarland No. 0.5的標(biāo)準濃度（約 1.5×108 CFU/mL），利用分光光度計測其 O.D.值為0.089，再使用微量吸管吸取0.5 mL 此菌液加入至4.5 mL TSBYE中作十倍稀釋， 序列稀釋五次後，採用最後一管稀釋液進行 各個培養(yǎng)基的效能評估。
培養(yǎng)基 效能評估使用的不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括： (i) TSA-II、(ii) Columbia agar、(iii) Brucella agar 及 (iv) BHIA，有關(guān)其等之組成分列於 表 2；以此四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基（均購自 BD 公司）配製成含5% 綿羊血之BAP（由啟新生 技公司配製）作為對照組，另外將上述各種 BAP額外添加相同濃度之溶血加強劑（啟新 生技公司提供）作為試驗組。
培養(yǎng)基之生長及 -溶血效能評估 操作步驟：將上述製備完成之菌液，以 微量吸管分別吸取0.05、0.1、0.15與 0.2mL 至各個試驗組與對照組之血平板中，再使用 無菌三角玻棒均勻塗抹平板表面，此實驗重 複操作二次，每次接種的血平板為兩個，接 著將所有平板倒置，培養(yǎng)於35±1℃培養(yǎng)箱中 24~48小時後，觀察各個培養(yǎng)基上的菌落生 長情形，並且量測菌落之溶血圈直徑(mm)，最終選擇50~250 CFU 菌量培養(yǎng)基之平板進 行計數(shù)。
溶血圈大小量測：利用帶表卡尺（太一 電子檢測有限公司，新北市）量測經(jīng)培養(yǎng)24 及 48小時後之各個平板上的菌落溶血圈直 徑，判讀時將培養(yǎng)皿底部正對光源，隨機採 取10個獨立分離菌落，觀察量測透明之溶血 圈直徑大小並取得平均值(mm)，最後再進行 比較試驗組與對照組之差異。比較方式為將 試驗組中以TSA-II為基礎(chǔ)培養(yǎng)基所配製的血 平板上菌落溶血環(huán)之大小作為基準(100%) 進 行計算，公式為：（含有各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 血平板上菌落溶血圈之直徑平均值/ 含 TSAII 基礎(chǔ)培養(yǎng)基之試驗組血平板上菌落溶血圈 之直徑平均值）×100%。
結(jié)果 單核球增多性李斯特菌在含有溶血加強 劑之TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 及 BHIA 基礎(chǔ)培養(yǎng)基所配製成的試驗組血平 板與未添加溶血加強劑的對照組血平板上， 分別接種濃度約1.5×103 CFU/mL李斯特菌 菌液，分別取0.05、0.1、0.15及 0.2 mL 的 量至各個試驗組與對照組之血平板培養(yǎng)基中 進行塗抹法，此實驗重複操作二次，每次接 種的血平板為兩個，經(jīng)35±1℃培養(yǎng)24~48小 時後，以獲得菌數(shù)落在50~250 CFU 範(fàn)圍之 平板進行計數(shù)及量測溶血圈大小，結(jié)果紀錄 於表3。添加於未添加溶血加強劑血平板的 菌落數(shù)均落在30%以內(nèi)，顯示細菌之生長效 能均為相同。 各個血平板上之李斯特菌菌落溶血圈的 直徑大小列於表4，比較含各基礎(chǔ)培養(yǎng)基之 血平板上的菌落之形狀與顏色，試驗組與對 照組並無明顯差異，當(dāng)培養(yǎng)24小時後的菌落 顯示為小型、邊緣完整、透明凸面且呈小圓 形，當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至48小時，菌落增大且變得 不透明，顏色呈灰白色。含有溶血加強劑的試驗組血平板中，與 未添加溶血加強劑之對照組血平板相比，不 論觀察時間為24或 48小時，試驗組的菌落 生長比對照組的溶血圈更擴散。（圖1）在 培養(yǎng)24小時後，含有溶血加強劑之試驗組血 平板菌落顯示明顯的溶血圈，而在培養(yǎng)48小 時後，含有溶血加強劑的試驗組血平板上， 菌落的溶血圈直徑皆更增大至約4 mm，甚 為清晰而易於觀察。
討論
本研究使用的四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基之試驗組 與對照組血平板上，各接種適當(dāng)濃度之菌液 0.05、0.1、0.15及 0.2 mL 進行塗抹法並操 作兩次，每次接種兩個血平板後，相同取量 的菌液在各種相同基礎(chǔ)培養(yǎng)基之試驗組與對 照組血平板上所生長之菌落數(shù)目無明顯差異 （表3），皆落在合理的誤差範(fàn)圍 (30%) 內(nèi) [13-14]。由此可知，溶血加強劑對於各種基礎(chǔ) 培養(yǎng)基之血平板並無抑制或促進菌落生長的 情形。 根據(jù)研究結(jié)果（表4）指出，以TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar及 BHIA作為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基之血平板，接種適當(dāng)濃度菌液並 培養(yǎng)24小時後，未添加溶血加強劑的對照組 血平板上，菌落溶血圈不明顯而不易觀察， 直至培養(yǎng)48小時後，才可稍微清楚看到溶血 圈；然而，添加溶血加強劑的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基 之試驗組血平板中，溶血現(xiàn)象明顯，相較於 對照組，其溶血圈環(huán)皆有增大情形，直徑皆 約為4 mm，就算不正對光源觀察，肉眼也 清楚可見，可使操作者更方便且正確觀察， 並可於較短的培養(yǎng)時間(24小時)內(nèi)更清楚明 顯地判讀其溶血情形，有利於操作者觀察李 斯特菌菌落的溶血現(xiàn)象，在食品或臨床檢驗 上，可降低漏檢或判讀錯誤的情況發(fā)生。 綜合上述結(jié)果，溶血加強劑添加於以 TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 及BHIA 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基之血平板中，均可促 進李斯特菌之 -溶血，使得溶血圈直徑增大， 且此溶血加強劑不會影響(抑制或促進)平板 上菌落的生長。因此，溶血加強劑對於食品 中分離的李斯特菌在血平板上進行溶血試驗 初步鑑定時，可更清楚明顯地辨識溶血情形， 而可協(xié)助鑑別李斯特菌的檢出，並且可縮短 一天的檢驗時間。同樣地，亦可協(xié)助臨床檢體之李斯特菌的分離，值得檢驗人員善加利 用。此溶血加強劑在未來或許也可以應(yīng)用於 協(xié)助鑑定其它各種臨床病原菌如 Propionibacterium acnes、Actinomyces neuii subsp. anitratus、Corynebacterium auris、Corynebacterium bovis、Corynebacterium coylae 及 Corynebacterium glyucuronolyticum[15]， 但須進一步評估。
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